豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

使用說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

通用名：豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

英文名：Test Kit for Antibodies to Porcine Epidemic Diarrhea Virus (ELISA)

【包裝規(guī)格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒

【預(yù)期用途】 豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，各種年齡的豬均易感。

本試劑盒用于檢測(cè)豬血清、血漿中豬流行性腹瀉病毒抗體，可用于豬流行性腹瀉病毒疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。

【原    理】

    本試劑盒由預(yù)包被豬流行性腹瀉病毒重組N蛋白的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測(cè)豬血清、血漿樣本中豬流行性腹瀉病毒抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí)在酶標(biāo)板中加入對(duì)照血清和待檢樣本，經(jīng)溫育后若樣品中含有豬流行性腹瀉病毒抗體，則將與酶標(biāo)板上抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的其他成分后；再加入酶標(biāo)記物，與酶標(biāo)板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，在孔中加TMB底物液，與酶標(biāo)結(jié)合物反應(yīng)形成藍(lán)色產(chǎn)物，顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成正相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)定各反應(yīng)孔中的吸光值，即可知樣品是否含有豬流行性腹瀉病毒抗體。

【試劑盒組成】

【儲(chǔ)存及有效期】 2～8℃保存，有效期12個(gè)月。

包被板開(kāi)封后請(qǐng)于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個(gè)月。

【適用儀器】 含450nm、630nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀，37℃恒溫設(shè)備，可調(diào)微量移液器。

【樣品準(zhǔn)備】

1.取動(dòng)物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無(wú)溶血、無(wú)污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長(zhǎng)期需置-20℃保存。

2.用樣品稀釋液將待檢血清按40倍稀釋?zhuān)ㄈ?μl血清加入195μl樣品稀釋液中，混勻）。陰、陽(yáng)性對(duì)照不用稀釋。

3.濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。

【檢驗(yàn)方法】

1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫。

2.取所需用量酶標(biāo)板條，設(shè)空白對(duì)照1孔、陰性/陽(yáng)性對(duì)照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。

3.空白對(duì)照孔加樣品稀釋液100μl；陰、陽(yáng)性對(duì)照孔分別加入陰、陽(yáng)性對(duì)照100μl；樣品孔每孔加入稀釋后的樣品100μl。

4.混勻，蓋好蓋板膜，置37℃（推薦水浴）避光反應(yīng)30分鐘。

5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加350 ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。

6.每孔加酶標(biāo)記物100μl（空白孔除外）。蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。

7.洗滌，同步驟5。

8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)10分鐘。

9.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光值，無(wú)參比波長(zhǎng)用空白孔調(diào)零(即所有孔吸光值減去空白孔吸光值)。

【參考值】實(shí)驗(yàn)正常的情況下，陰性對(duì)照的平均OD值即ODNC應(yīng)≤0.3，陽(yáng)性對(duì)照的平均OD值即ODPC應(yīng)≥0.6。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

1.樣品的OD值即ODS；

2.閾值計(jì)算：SP值=（ODS-ODNC）/（ODPC-ODNC）；

SP值≥0.2，結(jié)果判定為陽(yáng)性；SP值＜0.2，結(jié)果判定為陰性。

3.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)表明豬只抗體水平不足，建議補(bǔ)打相應(yīng)疫苗。

【試驗(yàn)方法的局限性】

    該試驗(yàn)僅作為定性檢測(cè)豬血清、血漿中豬流行性腹瀉病毒抗體，根據(jù)SP值高低可作抗體水平強(qiáng)、中、弱的粗略評(píng)估。

【注意事項(xiàng)】

1.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需戴手套、穿工作衣，嚴(yán)格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實(shí)驗(yàn)廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

2.終止液具有腐蝕性，應(yīng)避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請(qǐng)立即用大量自來(lái)水沖洗。

3.酶標(biāo)板從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫方可開(kāi)袋，未用完的酶標(biāo)板需放入有干燥劑的密封袋中保存。

4.濃縮洗滌液在低溫時(shí)容易結(jié)晶，使用時(shí)需恢復(fù)至室溫以完quan溶解。

5.洗滌時(shí)各孔均需加滿(mǎn)液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

6.用于檢測(cè)的樣品應(yīng)保持新鮮。

7.試驗(yàn)結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

8.不同批號(hào)試劑組分不得混用。